Gateway-Klonierung

2020-11-20T18:09:38Z

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Bei der '''Gateway-Klonierung''' handelt es sich um eine Methode zur [[Klonierung]]. Im Vergleich zur Klonierung durch [[Restriktionsenzym|Restriktion]] und [[Ligation]] hat sie eine höhere Klonierungseffizienz. Nach kurzer Zeit können bis zu 99 % positive [[Transformation (Genetik)|Transformanten]] erhalten werden.

Die Technik beruht auf dem sequenzspezifischen [[Rekombination (Genetik)|Rekombinationssystem]] des [[Bakteriophage Lambda|Phagen λ]] (einem Bakterienvirus), der mit Hilfe bestimmter Enzyme seine [[Desoxyribonukleinsäure|DNA]] in das [[Genom]] des Bakteriums ''[[Escherichia coli]]'' integriert. Der Integrationsprozess ([[Lysogener Zyklus|Lysogenie]]) wird hierbei von zwei [[Protein]]en katalysiert: der [[Integrase]] (Int) des Lambda-Phagen und den ''E. coli''-[[Protein-Untereinheit]]en IHF a und IHF b (''Integration Host Factors''). Dieser reversible Vorgang benötigt spezifische Sequenzabschnitte (die ''attachment sites'' oder ''recombination sites'' – deutsch etwa Verbindungs- oder Rekombinationsstellen) in der Ziel-DNA, zwischen denen die zu übertragenden genetischen Informationen eingefügt werden können. Für ihre Integration sind auch an den Enden dieser zu transferierenden DNA-Abschnitte Verbindungsstellen erforderlich.
Für die Exzision (Lyse) des DNA-Fragments wird zusätzlich das [[Enzym]] [[Exzisionase]] benötigt.

== Durchführung ==
Die Klonierung besteht im Wesentlichen aus drei Schritten.

=== 1.) Erzeugung eines ''attB''-PCR-Produkts ===
Um das [[Gen]] von Interesse letztendlich erfolgreich [[exprimieren]] zu können, muss es zuerst mit den ''attB''-Rekombinationsstellen versehen werden. Diese bestehen aus 25 Basenpaaren und werden von den an der Rekombination beteiligten Enzymen erkannt. Damit im Expressions-Vektor das Gen von Interesse im korrekten Leserahmen angeordnet ist, wurden die Verbindungsstellen für beide Enden des DNA-Abschnitts unterschiedlich konstruiert und zwar so, dass sie nach der Integration in den Donor-Vektor die richtige Orientierung erhalten.

Die Verbindungsstellen können zum Beispiel durch eine [[Polymerase-Kettenreaktion|PCR]] mit spezifischen [[Primer]]n, die am 5’-Ende die ''attB''-Stellen tragen, an das zu exprimierende Gen angefügt werden.

=== 2.) Erzeugung eines ''Entry Clones'' ===
Der zweite Schritt besteht im Austausch des im Donor-Vektor enthaltenen ''ccdB''-Gens gegen das PCR-Produkt (BP-Reaktion). Bei dem ''ccdB''-Gen handelt es sich um ein Selbstmordgen, dessen Genprodukt auf die im Labor normalerweise verwendeten Bakterienstämme toxisch wirkt, indem es die [[Gyrase]] hemmt, und das an seinen beiden Enden die ''attP''-Verbindungsstellen trägt.

Demnach sollten nach erfolgreicher Transformation nur diejenigen Bakterien überlebensfähig sein, bei denen der Austausch des ''ccdB''-Gens gegen das PCR-Produkt erfolgt ist.
Zusätzlich tragen die von Invitrogen erhältlichen Donor-Vektoren eine Antibiotika-Resistenz. Diese doppelte Selektion ist ein Grund für die hohe Effektivität dieser Klonierungsmethode. An der zwischen PCR-Produkt und Donor-Vektor erfolgenden BP-Reaktion sind die Enzyme Integrase und IHF a/b beteiligt. Die ''attB1''-''site'' reagiert hierbei spezifisch mit ''attP1'' und ''attB2'' mit ''attP2'', wodurch im entstehenden ''Entry Clone'' die ''attL''-Sequenzen generiert werden.
Als Nebenprodukt wird das mit den ''attR''-Stellen flankierte Selbstmordgen erhalten.

=== 3.) Erzeugung des Expressions-Vektors ===
Der dritte Schritt besteht aus der Reaktion zwischen ''Entry Clone'' und Ziel-Vektor (LR-Reaktion). Falls eine Genfusion herbeigeführt werden soll, kann der Ziel-Vektor 5’ oder 3’ der ''attR''-Seiten die entsprechende Sequenz tragen. Je nachdem ob im Genprodukt eine N-terminale oder C-terminale Fusion herbeigeführt werden soll. Beispielsweise kann der Ziel-Vektor die Sequenzen für fluoreszierende Proteine tragen, wenn durch [[FRET]] auf eine Protein-Protein Interaktion getestet werden soll.
Außerdem enthält der Ziel-Vektor das von den ''attR''-Stellen flankierte ''ccdB''-Gen. Durch die LR-Reaktion zwischen ''attL1'' und ''attR1'' und zwischen ''attL2'' und ''attR2'' werden im Expressions-Vektor erneut die ''attB''-Seiten generiert. Diese Reaktion entspricht also einer umgekehrten BP-Reaktion, für die zusätzlich das Enzym Exzisionase (Xis) benötigt wird.
Um erneut eine doppelte Selektion zu ermöglichen, trägt der Ziel-Vektor eine andere Antibiotika-Resistenz als der ''Entry Clone''. Als Nebenprodukt entsteht bei der LR-Reaktion außer dem Expressions-Vektor ein das Selbstmordgen ''ccdB'' tragendes [[Plasmid]]. Diese Transformanten gehen zu Grunde und nur die gewünschten Transformanten kommen zum Wachstum.

== Weblinks ==
* [http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=10600 Webseite von Invitrogen]
* [http://www.bio.davidson.edu/courses/Molbio/MolStudents/spring2000/patton/gateway.htm Gateway Cloning]
* [http://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/cloning/cloning_methods/recombination/gateway/index.html/ EMBL: Übersicht Gateway - System]
* [https://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/cloning/cloning_methods/gateway/lr_reaction/ EMBL: Creating a GATEWAY Expression Clone]

[[Kategorie:Biotechnologie]]

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