Quelltext der Seite Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion

Die '''Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion''' (englisch ''reverse transcription polymerase chain reaction'', kurz '''RT-PCR''') ist die Kombination von zwei Methoden der [[Molekularbiologie]] – die Nutzung der [[Reverse Transkriptase|Reversen Transkriptase]] (RT) und der [[Polymerase-Kettenreaktion]] (PCR) – um [[Ribonukleinsäure|RNA]] nachzuweisen, wie z.&nbsp;B. die [[Genexpression]] von spezifischen [[Gen]]en in [[Zelle (Biologie)|Zellen]], [[Gewebe (Biologie)|Geweben]] und [[Blutserum]] oder auch [[Ribozym]]e, [[Ribonukleoprotein]]e oder das [[Genom]] von [[RNA-Virus|RNA-Viren]]. Verwendet wird die RT-PCR in [[Forschung]] und [[Diagnostik]].

Die Abkürzung ''RT-PCR'' bezeichnet gelegentlich auch die [[Real Time Quantitative PCR]], was zu Verwechslungen führen kann, weshalb diese häufiger mit [[Real Time Quantitative PCR|qPCR]] abgekürzt wird. Eine Kombination von RT-PCR und qPCR wird dann als RT-qPCR bezeichnet.

== Geschichte ==
Reverse Transkriptasen wurden 1970 gleichzeitig durch [[Howard M. Temin]] im [[Rous-Sarkom-Virus]] (RSV) und durch [[David Baltimore]] im RSV und im ''[[Murines Leukämievirus|Moloney Murine Leukemia Virus]]'' (MoMLV) entdeckt.<ref>H. M. Temin, S. Mizutani: ''RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus.'' In: ''Nature'' (1970), Band 226(5252), S. 1211–3. Erratum in: Nature. 1970 227(5253):102. PMID 4316301.</ref><ref name="pmid4316300">{{cite journal | author = Baltimore D | title = RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses | journal = Nature | volume = 226 | issue = 5252 | pages = 1209–11 | year = 1970 | month = June | pmid = 4316300 | doi = 10.1038/2261209a0 }}</ref> Für ihre Entdeckung erhielten beide 1975 den [[Nobelpreis für Physiologie oder Medizin]], gemeinsam mit [[Renato Dulbecco]]. Die Erzeugung von [[cDNA]] aus RNA mit Hilfe von reversen Transkriptasen wurde erstmals im Jahr 1971 beschrieben.<ref>[[Sol Spiegelman|S. Spiegelman]], K. F. Watson, D. L. Kacian: ''Synthesis of DNA complements of natural RNAs: a general approach.'' In: ''Proc Natl Acad Sci U S A.'' (1971), Band 68(11), S. 2843–5. PMID 4330945; {{PMC|389539}}.</ref> Die anschließende [[Amplifikation (Genetik)|Amplifikation]] der erzeugten cDNA erfolgte erstmals 1976 mittels DNA-Polymerasen.<ref>A. Efstratiadis, F. C. Kafatos, A. M. Maxam, [[Tom Maniatis|T. Maniatis]]: ''Enzymatic in vitro synthesis of globin genes.'' In: ''Cell'' (1976), Band 7(2), S. 279–88. PMID 60178.</ref> Die Verwendung von [[Thermostabile DNA-Polymerase|thermostabilen DNA-Polymerasen]] erfolgte erstmals 1989.<ref name ="PMID 2483818">A. M. Carothers, G. Urlaub, J. Mucha, D. Grunberger, L. A. Chasin: ''Point mutation analysis in a mammalian gene: rapid preparation of total RNA, PCR amplification of cDNA, and Taq sequencing by a novel method.'' In: ''Biotechniques'' (1989), Band 7(5), S. 494–6, 498-9. PMID 2483818.</ref> Im Jahr 1990 wurde erstmals eine RT-PCR in einem Reaktionsansatz (engl. ''{{lang|en|One-Step-RT-PCR}}'') durchgeführt.<ref>A. L. Shaffer, W. Wojnar, W. Nelson: ''Amplification, detection, and automated sequencing of gibbon interleukin-2 mRNA by Thermus aquaticus DNA polymerase reverse transcription and polymerase chain reaction.'' In: ''Anal Biochem.'' (1990), Band 190(2), S. 292–6. PMID 2291473.</ref><ref>L. N. Sellner, R. J. Coelen, J. S. Mackenzie: ''Reverse transcriptase inhibits Taq polymerase activity.'' In: ''Nucleic Acids Res.'' (1992), Band 20(7), S. 1487–90. PMID 1374554; {{PMC|312227}}.</ref> Die [[Beurteilung eines binären Klassifikators#Spezifität|Spezifität]] der Reaktion konnte durch [[PCR-Optimierung#Hot-Start|Hot-Start-DNA-Polymerasen]] erhöht werden.

== Prinzip ==
Die RT-PCR ist ein in der Regel dreistufiger Prozess: nach einer [[RNA-Reinigung]] wird die RNA in DNA umgeschrieben, dann Teile der DNA spezifisch vermehrt. Um die [[Transkription (Biologie)|Transkription]] eines Genes, des [[Transkriptom]]s, eines Ribozym, von Ribonukleoproteinen oder das Genom von RNA-Viren nachzuweisen, muss die [[Ribonukleinsäure|RNA]] untersucht werden. Daher wird zuerst eine Reverse Transkriptase (RT) eingesetzt, eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, mit deren Hilfe RNA in [[cDNA]] umgeschrieben werden kann. Bei einer anschließenden [[Amplifikation (Genetik)|Amplifikation]] von [[Desoxyribonukleinsäure|DNA]] durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) werden spezifische [[thermostabile DNA-Polymerase]]n verwendet, die DNA-abhängig sind, d.&nbsp;h., sie sind nicht in der Lage, RNA zu amplifizieren. Die cDNA kann im Anschluss als Ausgangsmaterial in einer PCR verwendet werden, um spezifische Sequenzen aus dieser zu amplifizieren. Meistens wird zwischen der reversen Transkription und der PCR ein zehnminütiges Erhitzen auf 95 °C verwendet, bei der die reverse Transkriptase [[Denaturierung (Biochemie)|denaturiert]] wird. Die Produkte der RT-PCR lassen sich [[Gelelektrophorese|gelelektrophoretisch]] untersuchen und anschließend [[Klonierung|klonieren]] oder [[DNA-Sequenzierung|sequenzieren]].

Die heute eingesetzten Reversen Transkriptasen sind veränderte [[Enzym]]varianten aus unterschiedlichen [[Retroviren]], wie die des ''[[Murines Leukämievirus|Moloney Murine Leukemia Virus]]'' (MoMLV)<ref>M. J. Roth, N. Tanese, S. P. Goff: ''Purification and characterization of murine retroviral reverse transcriptase expressed in Escherichia coli.'' In: ''[[Journal of Biological Chemistry]].'' Band 260, Nummer 16, August 1985, S.&nbsp;9326–9335, PMID 2410413.</ref> oder des ''[[Avian Myeloblastosis Virus]]'' (AMV).<ref>F. Mallet, G. Oriol, C. Mary, B. Verrier, B. Mandrand: ''Continuous RT-PCR using AMV-RT and Taq DNA polymerase: characterization and comparison to uncoupled procedures.'' In: ''BioTechniques.'' Band 18, Nummer 4, April 1995, S.&nbsp;678–687, PMID 7541215.</ref> Die verschiedenen Varianten des Enzyms sind je nach Hersteller derart modifiziert worden, dass sie eine höhere Spezifität oder bessere Erträge generieren können, beispielsweise wird die im Enzym natürlich vorkommende [[RNase|RNase H]]-Aktivität deletiert.<ref>A. Telesnitsky, S. P. Goff: ''RNase H domain mutations affect the interaction between Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase and its primer-template.'' In: ''[[Proceedings of the National Academy of Sciences]].'' Band 90, Nummer 4, Februar 1993, S.&nbsp;1276–1280, PMID 7679498, {{PMC|45855}}.</ref><ref>L. Lu, T. Nakano, G. A. Smallwood, T. G. Heffron, B. H. Robertson, C. H. Hagedorn: ''A refined long RT-PCR technique to amplify complete viral RNA genome sequences from clinical samples: application to a novel hepatitis C virus variant of genotype 6.'' In: ''Journal of virological methods.'' Band 126, Nummer 1–2, Juni 2005, S.&nbsp;139–148, {{DOI|10.1016/j.jviromet.2005.01.031}}, PMID 15847930.</ref> Konventionelle zur [[RT-PCR]] verwendete [[reverse Transkriptase]]n [[Retroviren|retroviralen]] Ursprungs, wie die AMV- und die MoMuLV-Reverse-Transkriptase, sind bei 95&nbsp;°C nicht thermostabil. Bei den niedrigeren Temperaturen einer [[Reverse Transkription|reversen Transkription]] mit diesen Enzymen kommen jedoch unspezifische Bindungen von Primern an die DNA-Vorlage und [[Sekundärstruktur]]en in der DNA-Vorlage vor, welche zu unerwünschten Produkten führen und die Synthese des korrekten Produkts verhindern können. Allerdings kann die reverse Transkriptase von AMV bis zu 70&nbsp;°C eingesetzt werden.<ref>B. Fuchs, K. Zhang, M. G. Rock, M. E. Bolander, G. Sarkar: ''High temperature cDNA synthesis by AMV reverse transcriptase improves the specificity of PCR.'' In: ''Molecular biotechnology.'' Band 12, Nummer 3, Oktober 1999, S.&nbsp;237–240, {{DOI|10.1385/MB:12:3:237}}, PMID 10631680.</ref> Bei der reversen Transkriptase von MoMuLV wurden thermostabilere RNaseH-negative Mutante beschrieben (Mutationen E69K, E302R, W313F, L435G, N454K).<ref>B. Arezi, M. McCarthy, H. Hogrefe: ''Mutant of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase exhibits higher resistance to common RT-qPCR inhibitors.'' In: ''Analytical biochemistry.'' Band 400, Nummer 2, Mai 2010, S.&nbsp;301–303, {{DOI|10.1016/j.ab.2010.01.024}}, PMID 20100452.</ref> Weiterhin wurde die Vorlagenspezifität thermostabiler DNA-Polymerasen durch Austausch des Cofaktors (zweiwertige Magnesiumionen) gegen zweiwertige [[Mangan]]salze herabgesetzt, so dass mit einer DNA-abhängigen thermostabilen Polymerase auch RNA in einer RT-PCR als Vorlage zur Synthese von DNA eingesetzt werden konnte.<ref name="PMID 2483818" /> Da die Syntheserate der ''Taq''-Polymerase mit Manganionen relativ niedrig war, wurde bei dieser Variante der RT-PCR zunehmend die ''Tth''-Polymerase eingesetzt.<ref>T. W. Myers, D. H. Gelfand: ''Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase.'' In: ''Biochemistry'' (1991), Band 30(31), S. 7661–6. PMID 1714296.</ref> Jedoch erhöhte die Zugabe von Manganionen auch die Anzahl fehlerhafter Produkte und erhöhte die notwendige Menge an Vorlagen-DNA, weshalb diese Enzyme heute kaum noch zur reversen Transkription eingesetzt werden. Diese Probleme konnten mit der thermostabilen ''3173''-Polymerase aus thermophilen [[Bakteriophagen]] vermieden werden, welche die hohen Temperaturen einer PCR für eine längere Zeit übersteht und RNA als Vorlage bevorzugt.<ref>M. J. Moser, R. A. DiFrancesco, K. Gowda, A. J. Klingele, D. R. Sugar, S. Stocki, D. A. Mead, T. W. Schoenfeld: ''Thermostable DNA polymerase from a viral metagenome is a potent RT-PCR enzyme.'' In: ''PLoS One'' (2012), Band 7(6), S. e38371. {{DOI|10.1371/journal.pone.0038371}}. PMID 22675552; {{PMC|3366922}}.</ref>

Als RNA-abhängige DNA-Polymerase benötigt die Reverse Transkriptase ein kurzes DNA-Stück, einen so genannten [[Primer]], zur Initiation der Synthese der Komplementär-DNA (cDNA). Zur Analyse von [[Poly-A-Schwanz|poly-A-tragender]] mRNA wird hier ein sogenannter Oligo-d(T)-Primer verwendet, also mehrere [[Thymin]]-Basen, welche komplementär zum Poly(A)-Schwanz am [[3'-Ende]] der [[mRNA]] sind.

Sehr kurze RNA-Moleküle wie reife [[microRNA]]s sind viel zu klein (17–22 Basen) für den Einsatz üblicher Primer. Daher werden zur reversen Transkription dieser Nukleinsäuren besondere Schleifen-Primer eingesetzt, die nur am 3´Ende mit unter 10 Basen hybridisieren und so selektiv reife microRNAs (statt mRNAs) umschreiben.

Erst im zweiten Schritt der RT-PCR werden [[Gen]]-spezifische Primer eingesetzt. Bei einer modifizierten Variante, der ''One-Step RT-PCR'', werden stattdessen direkt Gen-spezifische Primer verwendet und beide Reaktionen werden hintereinander im selben Gefäß ausgeführt. Bei der Zero-Step RT-PCR entfällt darüber hinaus der isothermale Zwischenschritt, der sonst bei der reversen Transkription und vor der PCR-Reaktion durchgeführt wird. Durch die hohe Thermostabilität des biotechnologisch veränderten Enzyms können beide Reaktionen parallel im selben Gefäß ablaufen. Gleichzeitig werden durch die höhere Temperatur von über 55&nbsp;°C Sekundärstrukturen der RNA dauerhaft aufgebrochen. Eine weitere Variante der RT-PCR ist die ''[[RACE-PCR]]''.

== Anwendungen ==
Da eine cDNA zur ursprünglichen mRNA komplementär ist, kann aus dieser anhand des [[Genetischer Code|genetischen Codes]] auch die [[Aminosäure]]nsequenz eines [[Protein]]s abgeleitet werden, für welches diese mRNA codiert. Da eine mRNA in [[Eukaryoten]] nach ihrer Transkription bereits modifiziert und [[Splicing|gespleißt]] wurde, ist sie im Gegensatz zum Gen auch [[Intron]]-frei. Darüber hinaus ermöglicht diese cDNA auch Informationen darüber zu erhalten, ob das dazugehörige Gen in verschiedenen [[Isoform]]en exprimiert wird, d.&nbsp;h., die mRNA [[Alternatives Splicing|alternativ gespleißt]] wird. Über RT-PCR lässt sich also gezielt Genexpression nachweisen. Genutzt wird die RT-PCR auch bei der Diagnose von [[RNA-Virus|RNA-Viren]] im Blutserum, wie [[HIV]] und in jüngerer Zeit häufig auch im Zusammenhang mit [[Influenza A/H5N1]] und [[SARS-CoV-2]].

Bei einem [[Northern Blot]] können die [[Hybridisierungssonde]]n per RT-PCR hergestellt werden. Zur Analyse des [[Transkriptom]]s wird die gesamte RNA in einer RT-PCR mit einer Mischung kurzer Primer (engl. ''{{lang|en|random hexamers}}'') in cDNA umgeschrieben und kopiert. Im Anschluss erfolgt meistens ein [[Microarray]] oder eine Sequenzierung der cDNAs. Hier reicht häufig die Ermittlung von ''[[Expressed Sequence Tag]]s'' (EST) zur Identifizierung der Transkripte.

== Qualitätssicherung ==
Zur Qualitätssicherung der Methodik fanden bereits umfangreiche Untersuchungen statt.<ref>Jiang Y, Cai D, Chen D, Jiang S: ''The cost-effectiveness of conducting three versus two reverse transcription-polymerase chain reaction tests for diagnosing and discharging people with COVID-19: evidence from the epidemic in Wuhan, China.'', BMJ Glob Health. 2020 Jul;5(7):e002690, PMID 32694221</ref><ref>Ambrosi C, Prezioso C, Checconi P, Scribano D, Sarshar M, Capannari M, Tomino C, Fini M, Garaci E, Palamara AT, De Chiara G, Limongi D: ''SARS-CoV-2: Comparative analysis of different RNA extraction methods.''J Virol Methods. 2021 Jan;287:114008,   PMID 33160015</ref><ref>Reijns MAM, Thompson L, Acosta JC, Black HA, Sanchez-Luque FJ, Diamond A, Parry DA, Daniels A, O’Shea M, Uggenti C, Sanchez MC, O’Callaghan A, McNab MLL, Adamowicz M, Friman ET, Hurd T, Jarman EJ, Chee FLM, Rainger JK, Walker M, Drake C, Longman D, Mordstein C, Warlow SJ, McKay S, Slater L, Ansari M, Tomlinson IPM, Moore D, Wilkinson N, Shepherd J, Templeton K, Johannessen I, Tait-Burkard C, Haas JG, Gilbert N, Adams IR, Jackson AP: ''A sensitive and affordable multiplex RT-qPCR assay for SARS-CoV-2 detection.'', PLoS Biol. 2020 Dec 15;18(12):e3001030, PMID 33320856.</ref> Auch [[Centers for Disease Control and Prevention|CDC-Untersuchungen]] gemäß der [[ISO-Norm]] hier jedoch für die [[Real Time Quantitative PCR]] wurden im internationalen Rahmen durchgeführt, die auch [[Veterinärmedizin|veterinärmedizinisches]] Untersuchungsgut betrafen.<ref>Deng K, Uhlig S, Ip HS, Lea Killian M, Goodman LB, Nemser S, Ulaszek J, Pickens S, Newkirk R, Kmet M, Frost K, Hettwer K, Colson B, Nichani K, Schlierf A, Tkachenko A, Reddy R, Reimschuessel R: '' Interlaboratory comparison of SARS-CoV2 molecular detection assays in use by U.S. veterinary diagnostic laboratories.'', J Vet Diagn Invest. 2021 Nov;33(6):1039-1051, PMID 34293974.</ref>

== Literatur ==
* Cornel Mülhardt: Der Experimentator: Molekularbiologie/Genomics. Sechste Auflage. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2008, ISBN 3-8274-2036-9.
* [[Joseph Sambrook|J. Sambrook]], [[Thomas Maniatis|T. Maniatis]], D. W. Russel: ''Molecular cloning: a laboratory manual.'' 3rd edition (2001), [[Cold Spring Harbor Laboratory]] Press. ISBN 0-87969-577-3

== Einzelnachweise ==
<references />

[[Kategorie:Molekularbiologie]]
[[Kategorie:Biochemisches Nachweisverfahren]]
[[Kategorie:Nukleinsäure-Methode]]