Genkanone
Eine Genkanone (englisch {{#invoke:Vorlage:lang|flat}}) ist ein Gerät, das dazu dient, DNA, RNA oder Proteine mit Hilfe von Partikeln in Zellen zu schießen (engl. {{#invoke:Vorlage:lang|flat}} oder auch {{#invoke:Vorlage:lang|flat}}, von bio-ballistic). Neben der Protoplastentransformation und der Agrobakterien-vermittelten Transformation ist der Partikelbeschuss mit einer Genkanone eine etablierte Methode zur Erzeugung transgener Organismen oder für die transiente Transfektion zur Erzeugung einer Immunantwort.
Geschichte
Das Konzept der Genkanone wurde von Edward Wolf und Nelson Allen der Cornell Nanofabrication Facility sowie von den Pflanzenphysiologen John Sanford und Theodore Klein der Cornell University 1987 erfunden.<ref name="klein2">Sanford, J. C., T. M. Klein et al. (1987). Delivery of substances into cells and tissues using a particle bombardment process. Journal of Particulate Science and Technology 5: 27–37.</ref> Die Rechte zur kommerziellen Verwertung der Produkte wurden 1990 an die Firma DuPont verkauft.
Neben der Anmerkung der Entwickler, die Methode universell für das Einbringen von Substanzen in lebende Zellen<ref name="klein1"/> zu verwenden, lag ursprünglich das Hauptaugenmerk auf der Entwicklung einer Methode, um Pflanzen zu transformieren, welche mit anderen Transformationsmethoden nicht zugänglich waren. Beispielsweise war es zum Zeitpunkt der Entwicklung der Methode nicht möglich, Monokotyle mit Agrobacterium tumefaciens zu transformieren.<ref name="klein1"/> Mit der Methode des Particle Bombardements lassen sich fast alle Pflanzen transformieren, auch das Einbringen von Plasmiden in Plastide ist möglich. Obwohl Pflanzen selbst keine Plasmide aufweisen, können sie die Plasmid-DNA auf den Partikeln in ihr eigenes Genom integrieren. Eine Transfektion ist dabei entweder transient, also nur vorübergehend, oder stabil mit einer Vererbung in die nächsten Generationen durch eine Integration der DNA ins Genom. Mittlerweile sind jedoch für alle monokotylen Getreide, darunter auch Mais<ref>Ishida, Y., Y. Hiei et al. (2007). Agrobacterium-mediated transformation of maize. Nature Protocols 2(7): 1614–1621.</ref><ref>Ishida, Y., H. Saito et al. (1996). High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Nature Biotechnology 14(6): 745–750.</ref> und Gerste<ref>Tingay, S., D. McElroy et al. (1997). Agrobacterium tumefaciens-mediated barley transformation. Plant Journal 11(6): 1369–1376.</ref>, Protokolle für die Transformation mit Agrobakterien veröffentlicht worden.
Die Genkanone wurde 1990 das erste Mal an Tieren angewendet<ref>N. Yang, J. Burkholder, B. Roberts, B. Martinell, D. McCabe: In vivo and in vitro gene transfer to mammalian cells by particle bombardment. In: PNAS 87:9568 (1990)</ref> und ab 1993 auch zu Immunisierungszwecken verwendet.<ref>J. B. Ulmer, J. J. Donnelly, S. E. Parker, G. H. Rhodes, P. L. Felgner, V. J. Dwarki, S. H. Gromkowski, R. R. Deck, C. M. DeWitt, A. Friedman: Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein. In: Science 259(5102):1745-9 (1993)</ref> Dafür wird eine mobile Variante in Form einer Hochdruckpistole verwendet, die an eine Stickstoffdruckflasche angeschlossen ist. Die Stromversorgung erfolgt über eine 9-Volt-Batterie.
Partikelbeschaffenheit
Die Partikel bestehen in den meisten Fällen aus Gold oder Wolfram und werden mit Plasmid-DNA beschichtet. Das Schießen erfolgt mit Gasdruck. Die Entwickler der Methode setzten zunächst Wolframpartikel mit einem Durchmesser von 4 µm ein.<ref name="klein1">Klein, T. M., E. D. Wolf et al. (1987). High-velocity microprojectiles for delivering nucleic-acids into living cells. Nature 327(6117): 70–73.</ref><ref name="klein1"/> In neuerer Zeit werden meistens kleinere Partikel verwendet, beispielsweise Goldpartikel mit einer Größe von 1,0 µm oder 0,6 µm.<ref name="frame1">B. R. Frame, H. Y. Zhang et al. (2000). Production of transgenic maize from bombarded type II callus: Effect of gold particle size and callus morphology on transformation efficiency. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant 36(1): 21–29.</ref> Es konnte belegt werden, dass kleinere Partikel die Effektivität, mit dem Beschuss transgene Pflanzen zu erzeugen, deutlich erhöhen.<ref name="frame1"/> Die Partikel werden mit einem Polyamin (z. B. Spermidin)<ref>S. Wang, S. Joshi, S. Lu: Delivery of DNA to skin by particle bombardment. In: Methods in molecular biology. Band 245, 2004, S. 185–196, PMID 14707379.</ref> beschichtet, um die Adsorption der DNA an die Partikel zu verbessern. Nach der DNA-Beschichtung erfolgt meistens eine letzte Beschichtung mit einem kationischen Polymer (z. B. Polyvinylpyrrolidon), um die Transfektionseffizienz zu verbessern.
Zielgewebe
Als Zielgewebe (target) für die Erzeugung transgener Pflanzen kann beispielsweise epidermales Gewebe<ref name="klein1"/> oder Kallusmaterial<ref name="frame1"/> verwendet werden. Die Partikel durchdringen dabei tausende von Zellen simultan und ermöglichen es, DNA in Zellen in situ einzubringen.<ref name="klein1"/>
Vor- und Nachteile
Vorteil des Partikelbeschusses ist zwar in den meisten Fällen eine höhere Effektivität, allerdings ist die Anzahl der stabilen Integrationen von Fremd-DNA in das Genom, im Vergleich zur Agrobakterien-Transformation, in den meisten Fällen geringer. Zu bedenken sind auch die hohen Beschaffungs- sowie Betriebskosten für eine Genkanone. Die Protoplastentransformation und die Agrobakterien-vermittelte Transformation sind hierbei deutlich kostengünstiger.
Bei Impfzwecken zeigt sich durch die zelluläre Expression und die Präsentation der Peptide an Haupthistokompatibilitätskomplex MHC-I eine zelluläre Immunantwort. Weitere Merkmale sind eine hohe Reproduzierbarkeit bei hundertfach niedrigerer Dosierung im Vergleich zur intramuskulären Injektion von Plasmiden<ref>T. M. Pertmer, M. D. Eisenbraun, D. McCabe, S. K. Prayaga, D. H. Fuller, J. R. Haynes: Gene gun-based nucleic acid immunization: elicitation of humoral and cytotoxic T lymphocyte responses following epidermal delivery of nanogram quantities of DNA. In: Vaccine 13(15):1427-30 (1995).</ref> und eine Expression in situ mit korrekter Proteinfaltung und allen posttranslationalen Modifikationen. Das Verfahren ist nadelfrei und kommt ohne Kühlkette aus.
Siehe auch
Weblinks
- Richtest du schon mal die Kanone? Pflanzenzellen werden am MPI mit Hilfe der Partikelkanone gentechnisch verändert (mit Video).
Einzelnachweise
<references />