Taq-Polymerase
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| Eigenschaften des menschlichen Proteins
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| Masse/Länge Primärstruktur | 835 Aminosäuren
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| Reaktionsart |
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| Substrat | Desoxyribonucleosidtriphosphat + DNAn
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| Produkte | Diphosphat + DNAn+1
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Die Taq-Polymerase ist die thermostabile DNA-Polymerase des Bakteriums Thermus aquaticus (Taq). Dieses Bakterium, das in Geysiren bei etwa 70 °C lebt wurde erstmals 1969 von Thomas D. Brock und Hudson Freeze isoliert.<ref name="DOI10.1128/jb.98.1.289-297.19692">Thomas D. Brock, Hudson H. Freeze: Thermus aquaticus gen. n. and sp. n., a Nonsporulating Extreme Thermophile. In: Journal of Bacteriology. 1969, Band 98, Nummer 1, S. 289–297 {{#invoke:Vorlage:Handle|f|scheme=doi|class=plainlinks|parProblem=Problem|errCat=Wikipedia:Vorlagenfehler/Parameter:DOI|errClasses=error editoronly|errHide=1|errNS=0 4 10 100}}.</ref> Taq-Polymerase ist außerordentlich hitzebeständig und gehört zu den Extremozymen. 1976 wurde die Taq-Polymerase erstmals von Alice Chien isoliert.<ref name="DOI10.1128/jb.127.3.1550-1557.1976">Alice Chien, D B Edgar, John M. Trela: Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus. In: Journal of Bacteriology. 1976, Band 127, Nummer 3, S. 1550–1557 {{#invoke:Vorlage:Handle|f|scheme=doi|class=plainlinks|parProblem=Problem|errCat=Wikipedia:Vorlagenfehler/Parameter:DOI|errClasses=error editoronly|errHide=1|errNS=0 4 10 100}}.</ref>
Eigenschaften
Das Enzym wird hauptsächlich zur DNA-Vervielfältigung mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion eingesetzt. DNA-Polymerasen von mesophilen Organismen würden bei Erhitzung während der Polymerase-Kettenreaktion denaturiert und müssten nach jedem Zyklus neu hinzugegeben werden. Bei der DNA-Vervielfältigung mit Taq-Polymerase ist dies nicht notwendig, da das Enzym auch bei hohen Temperaturen noch sehr stabil ist (die Enzym-Halbwertszeit beträgt bei 97,5 °C ca. 9 Minuten<ref name="Lawyer et al">{{#invoke:Vorlage:Literatur|f}}</ref>). Die DNA-Amplifikation mit Taq ist jedoch fehleranfällig, denn das Enzym besitzt keine 3' → 5'-Exonukleaseaktivität und damit keine proof reading-Funktion. Die Fehlerrate der Taq-Polymerase beträgt 8 · 10−6 Fehler pro Basenpaar.<ref name="Cline">J. Cline, J. C. Braman, H. H. Hogrefe: PCR fidelity of pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases. In: Nucleic Acids Research. (1996), Bd. 24(18), S. 3546–51. PMID 8836181; }} PMC 146123 (freier Volltext{{#if:|, PDF}}).</ref> In den amplifizierten DNA-Fragmenten finden sich deshalb häufig Mutationen, die durch ungenaues Kopieren des Matrizenstranges entstehen. Werden sequenzexakte DNA-Amplifikate benötigt, empfiehlt sich daher der Einsatz von Polymerasen mit proof reading-Funktion, etwa von Pfu-, Pwo-Polymerase oder Pfx-Polymerasen (die ursprünglich ebenfalls aus thermophilen Mikroorganismen isoliert wurden), deren Einsatz jedoch kostenintensiver ist.
Bei der Amplifikation eines DNA-Fragments hängt die Taq-Polymerase ein zusätzliches Nukleotid (dATP) an das 3'-Ende des synthetisierten Strangs. Man spricht von einem 3'-A-Überhang (A für Adenin), da sich auf dem Matrizenstrang keine komplementäre Nukleobase (Thymin) befindet. Der 3'-Überhang wird durch das Fehlen der proof reading-Funktion nicht korrigiert und findet Anwendung beim Verfahren der TA-Klonierung. Durch eine Deletion der ersten 289 Aminosäuren wird das Stoffel-Fragment erzeugt.<ref>S. Dabrowski, J. Kur: Recombinant His-tagged DNA polymerase. II. Cloning and purification of Thermus aquaticus recombinant DNA polymerase (Stoffel fragment). In: Acta biochimica Polonica. Band 45, Nummer 3, 1998, S. 661–667, PMID 9918492.</ref>
Die Massenproduktion des Enzyms erfolgt durch Übertragung des Gens auf einen Stamm des Bakteriums Escherichia coli. Aus diesen Kulturen wird das Protein gereinigt und in einem glycerolhaltigen Puffer bei −20 °C aufbewahrt.
Weblinks
- Taq-DNA-Polymerase. Auf: spektrum.de: Lexikon der Biologie. Stand: 1999.
Einzelnachweise
<references />